UMI

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UMI，全称是Unique Molecular Identifier，中文意思是“独特分子标识符”。它在单细胞测序（尤其是scRNA-seq）中扮演着纠正定量偏差、实现更精确分子计数的“幕后英雄”角色。

  1. UMI是什么？

    UMI通常是一段短的（比如6-12个核苷酸）、随机合成的DNA序列。在单细胞实验的早期步骤中，这些UMI会被整合到我们想要研究的分子（比如mRNA）的反转录产物（cDNA）上。

  2. UMI是如何被添加的？

    在单细胞RNA测序流程中，当细胞裂解后释放出mRNA，这些mRNA会被带有oligo-dT（用于捕获mRNA的polyA尾）、细胞条形码（标记细胞身份）以及UMI的引物捕获。在反转录酶的作用下，当mRNA被逆转录成cDNA时，每一条原始的mRNA分子（理论上）就会在其对应的cDNA拷贝上“随机分配”并连接上一个独特的UMI序列。

  3. UMI的核心作用：消除PCR扩增偏好，实现精确计数

    这是UMI最重要的功能。在后续的实验步骤中，为了获得足够的DNA量进行测序，我们需要对产生的cDNA进行PCR扩增。然而，PCR扩增过程并非完美均一：

    • 扩增偏差 (Amplification Bias)：有些cDNA分子可能因为序列特性或其他随机因素，比其他cDNA分子更容易或更有效地被扩增。这意味着，如果一条原始的mRNA分子A被扩增了100次，而另一条原始的mRNA分子B只被扩增了10次，仅仅通过计算测序后A和B的读长数量，我们就会错误地认为细胞中A的原始数量是B的10倍，而实际上它们可能都只有1个原始分子。

    UMI如何解决这个问题？

    • 因为（理想情况下）每个原始的mRNA分子在反转录时都带上了一个独特的UMI，所以即使经过多轮PCR扩增，所有源自同一个原始mRNA分子的扩增产物（cDNA拷贝）都会共享相同的细胞条形码和相同的UMI。
    • 在数据分析时，对于某个特定基因，在某个特定细胞（由细胞条形码确定）中，我们不再是简单地计算所有映射到这个基因的测序读长数量。相反，我们去统计有多少种不同的UMI序列与这个基因的读长相关联。
    • 每种不同的UMI就代表了细胞中一个原始的mRNA分子。

    举个例子：
    假设在细胞X中，对于基因Y，我们有：

    • 一个原始的mRNA分子，我们称之为 mRNA_Y1。在反转录时，它被打上了一个独特的分子标识符，我们称之为 UMI_A。经过PCR扩增后，可能产生了50个都带有这个UMI_A的cDNA拷贝。
    • 细胞X中，基因Y的另一个原始mRNA分子，我们称之为 mRNA_Y2。在反转录时，它被打上了另一个独特的分子标识符，我们称之为 UMI_B。经过PCR扩增后，可能产生了20个都带有这个UMI_B的cDNA拷贝。

    在测序和数据分析后：

    • 如果我们仅仅计算所有与基因Y相关的测序读长数量，那么我们会得到 50 (来自mRNA_Y1的扩增产物) + 20 (来自mRNA_Y2的扩增产物) = 70条读长。
    • 但是，因为我们使用了UMI，我们会去识别这些读长所携带的UMI种类。我们发现，所有这70条读长，实际上只对应着两种不同的UMI序列：UMI_A 和 UMI_B。

    因此，尽管总共检测到了70条基因Y的测序读长，但通过识别不同的UMI，我们就知道在细胞X中，基因Y最初实际上只有2个原始的mRNA分子（一个对应UMI_A，另一个对应UMI_B）。

  4. 更准确的基因表达定量：

    通过这种方式，UMI能够帮助我们更准确地估计每个细胞中每个基因的原始转录本数量，从而得到更可靠的基因表达谱。这对于比较不同细胞间或不同条件下基因表达的细微差异至关重要。

总结一下，UMI就像是给每个原始RNA分子在变成cDNA时贴上了一个独一无二的小标签。无论这个分子后来被复制了多少次，通过识别这些独特的小标签，我们就能追溯到最初有多少个原始分子，从而实现更精确的定量。